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类器官与多组学技术助力新药研发
发布时间:2020-04-10 10:11:31 | 浏览次数:

作者:CX-Chase Chen

 类器官技术自诞生以来,由于其具有与体内更接近的细胞构成、细胞间相互作用以及基因表达几功能(相对2D细胞系而言),一直被认为是新药开发的有力工具。许多研究也已经声明类器官在新药研究过程中比2D细胞系模型更具有生物学意义,并可以完成高通量的体外筛选[1, 2]近年来,基于类器官技术的新药研发研究也越来越多。今天,小编给大家分享最近的一篇基于类器官进行新药研发的文章,该文章发表在Nature Chemical Biology(IF=17.728)由来自美国哈佛大学丹娜法伯癌症研究院的团队完成,以胰腺导管腺癌(PDAC)的类器官为研究模型,针对潜在靶点DCLK1进行了药物筛选并通过多组学方法阐述了药物的作用机制(图1[3]

图1. 该文章的基本实验流程概念图

抗肿瘤靶向药的研发往往都是以激酶为靶标,其中也诞生了众多著名的靶标以及相关的药物。但是也有一些重要的靶点仍有待研发,而类双皮质素激酶1(Doublecortin like kinase 1,DCLK1)就是其中之一。前期研究证明该蛋白的上调可以增强肿瘤的侵袭性并与耐药性产生密切相关[4]而抑制DCLK1可以引发细胞毒性并降低PDL1的分泌[5, 6] 。因此DCLK1的特异性抑制剂可以作为一个重要的药物研发靶点。本文利用具有高度临床相似性的类器官模型,筛选出一种具有良好肿瘤抑制作用的DCLK1抑制剂DCLK1-IN-1,并对DCLK1的抑制效果进行了分析,并通过转录组学、蛋白组学、磷酸化蛋白组学的多组学联合方法,分析了DCLK1抑制后的详细分子水平的变化。

在之前的研究中,作者通过化学蛋白组学方法,从350个候选化合物中,筛选出一类地西平化合物并进行了构效分析,本文主要讨论的化合物便是此类化合物的优化结果,称为DCLK1-IN-1,并使用另一无效的化合物DCLK-NEG作为阴性对照(图2a)。首先,作者通过等温滴定法检测,说明DCLK1-IN-1是可以与重组DCLK1蛋白结合的(图2b),并通过ATP法与NanoBERT法进一步确认DCLK1-IN-1与DCLK1蛋白的结合(图2c-f)。

图2. DCLK1-IN-1可以与DCLK1蛋白结合

此外,作者还通过KINOMEscan®药物激酶筛选平台对450中人体内的激酶进行了特异性筛选,发现DCLK1-IN-1是DCLK1激酶的特异性抑制剂,并对其结合位点进行了分子对接预测。

图3. DCLK1-IN-1的特异性激酶筛选(a,b)以及分子对接(c)

为了验证DCLK1-IN-1的安全性,作者进行了细胞毒性试验以及小鼠药代动力学试验,证实该化合物具有有利于成药的药代动力学特性及较低的细胞毒性。为了充分验证DCLK1-IN-1对胰腺癌细胞的毒性,作者选用了两个细胞株PATU-8988T和PATU-8902,并通过降级标签系统(dTAG system)验证DCLK1的表达是由KRAS/ERK通路进行调控的,且DCLK1-IN-1的处理不会影响肿瘤细胞形成3D微球(图4a-e)。在后续的细胞实验中,无论是2D培养还是3D细胞微球,DCLK1-IN-1对细胞活力影响甚微(图4f),但是MEK1/2、BET、和pan-ERK5/LRRK2/NRD4/DCLK1等抑制剂对细胞活力由显著影响(图4g)。

 图4. DCLK1对胰腺癌细胞系的细胞活力的影响

对细胞系没有作用是否就意味着DCLK1-IN-1或者DCLK1不是一个潜在的药物或者靶点呢?作者进一步使用4例PDAC患者来源的类器官对DCLK1抑制剂进行了检测(基于384孔板的ATP法),发现其中两例类器官中,DCLK1-IN-1可以有效抑制肿瘤细胞的活力(图5a)。这两例患者分别是:一位FOLFIRINOX耐药后患者的肝转移灶,一位正在使用曲美替尼的胰腺癌患者的肝转移灶。然而,另一位有DCLK1治疗潜力的患者(MAPK与ERK通路激活)的类器官却对DCLK1-IN-1耐药。为了进一步探究DCLK1抑制剂对类器官有效的分子机制,研究团队对两个对DCLK1-IN-1敏感的类器官以及PATU-8988T细胞系在药物处理前后进行了多组学分析,包括转录组、蛋白组以及磷酸化蛋白组(图5b-g)。结果表明,DCLK1-IN-1处理后,类器官有显著的细胞活动能力相关基因、蛋白及磷酸化蛋白的改变,但细胞系中未见此类变化。在最敏感的类器官(PANFR72_T2)中,细胞凋亡与MET驱动的癌变相关蛋白和蛋白磷酸化有显著改变,但在另一个类器官及细胞系中没有发现。总体而言,DCLK1-IN-1在蛋白和磷酸化水平的改变是比较少的,但是其中关于细胞动力的蛋白显著下调,而一些变化则倾向于细胞凋亡,这也揭示了为何DCLK1抑制后,类器官的细胞活力有显著降低。

图5. DCLK1-IN-1对病人来源类器官的作用(a),以及转录组(b,e),蛋白组(c,f),

以及磷酸化蛋白组(d,g)的差异基因、蛋白或磷酸化蛋白。

本文主要讨论了一种新的潜在药物靶点DCLK1,及其抑制剂DCLK1-IN-1,在PDAC中的作用机制。DCLK1作为肿瘤相关的基因一直有被讨论和研究,但是细胞实验表明抑制DCLK1并不能使肿瘤细胞活性受到抑制,如果照此路线发展下去,DCLK1可能不会被作为一个药物相关基因被继续研究,其抑制剂也不会作为潜在药物继续进行毒理及动物实验。有意思的是,一个无法抑制肿瘤细胞系的靶向抑制剂,在病人来源的类器官中体现了比较明显的抑制作用。在多组学分析中,类器官在药物处理前后变化的蛋白与磷酸化的变化与细胞动力和凋亡相关,但是在细胞系的组学分析中却没见到这些变化,这一结论与类器官及细胞系在DCLK1-IN-1处理后的表型是一致的。

从组学的角度而言,本研究采用了三个维度的组学分析,包括转录组、蛋白组和磷酸化蛋白组,来分析RNA、蛋白、激酶水平的变化。目前对类器官的蛋白和磷酸化水平探索的文章还比较少,这也使得本文从方法学上是具有新颖性的。就总体通量而言,这算是一个及格的组学研究(8000+蛋白,6000+磷酸化蛋白)但是,其差异基因、蛋白及磷酸化都比较少,差异蛋白与磷酸化蛋白只有<500个(图6a,c),并且只进行了两个样本的检测,似乎与传统蛋白组学所需的重复数量(至少3重复)不符。但是本文正好利用了类器官技术体现个体化的病人特征这一特性,对两例患者分别分析,加上类器官取材和培养的难度限制,所以,目前类器官样本进行组学分析似乎没有受到传统生物学重复观念的束缚。

此外,如果将两个患者蛋白组的差异蛋白和磷酸化蛋白组的差异磷酸化蛋白进行Venn分析取交集(小编自己多手玩了一下)的话,其共同差异还是很少的(33差异蛋白,51差异磷酸化蛋白)。这些差异蛋白主要为细胞周期调控蛋白和代谢相关蛋白,而差异磷酸化蛋白主要功能则为mRNA相关功能,上皮细胞发育等等,其实与类器官表型的相关性还是比较大的(图6)。但由于人源样本具有个体化差异,这些较少的差异蛋白或蛋白磷酸化难以进行系统化的生信分析并得出显著性结论。在本文中,作者也未对多组学结果进行关联分析,甚至没有进行验证。

总而言之,本文体现了类器官模型在新药研发中的重要意义,传统的细胞系研究会使得一些本来重要的靶点和化合物被忽略,而类器官由于具有较复杂的细胞构成和更接近体内的3D结构,使得其基因表达与蛋白功能与体内更接近。并且病人来源的类器官所得到的体外药物实验结果与机制具有患者的个体化特征且更接近于体内的真实情况,因此类器官模型必将在新药研发的过程中扮演越来越重要的角色。从研究角度来看,由于类器官的生物学特性和可操作性,类器官与多组学的结合也很有可能成为高分文章中常见的组合拳,助力研究人员获得更具新意与生物学意义的成果。

图6. 两个对DCLK1-IN-1敏感的患者来源类器官的蛋白组学(a)与磷酸化蛋白组学(c)的差异蛋白与差异磷酸化蛋白的Venn图。以及两患者共有差异蛋白(b)与差异磷酸化蛋白(d)的PPI相互作用网络(使用string-db.org制作)。



参考文献

1. Han, K., et al., CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature, 2020. 580(7801): p. 136-141.

2. Fontoura, J.C., et al., Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2020. 107: p. 110264.

3. Ferguson, F.M., et al., Discovery of a selective inhibitor of doublecortin like kinase 1. Nat Chem Biol, 2020.

4. Qu, D.F., et al., Overexpression of DCLK1-AL Increases Tumor Cell Invasion, Drug Resistance, and KRAS Activation and Can Be Targeted to Inhibit Tumorigenesis in Pancreatic Cancer. Journal of Oncology, 2019. 2019.

5. Yan, R., et al., Inhibition of DCLK1 down-regulates PD-L1 expression through Hippo pathway in human pancreatic cancer. Life Sciences, 2020. 241.

6. Kawamura, D., et al., Enhancement of cytotoxic effects of gemcitabine by Dclk1 inhibition through suppression of Chk1 phosphorylation in human pancreatic cancer cells. Oncology Reports, 2017. 38(5): p. 3238-3244.



 

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